流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種在功能水平上對液流中排成單列的動物、植物等細胞或其它生物微粒（如微球、細菌、病毒等）逐個進行多參數(shù)定量分析和分選的檢測手段。該技術可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準確性好、方法靈活等優(yōu)點。流式細胞術不僅能夠測量細胞的大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還能檢測細胞表面和胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA及RNA的含量。此外，流式細胞術能夠從單細胞水平同時分析細胞樣本中的基因表達和蛋白表達，還可以檢測細胞活性、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖和細胞氧化等細胞功能。該技術不僅能獲得在單個細胞水平上具有統(tǒng)計學意義的海量數(shù)據(jù)，還可以更加深入地了解異質(zhì)性細胞群的詳細信息。隨著流式細胞術水平的不斷提升，其應用范圍也日益廣泛，目前已普遍應用于免疫學、干細胞學、血液學、腫瘤學、藥物學、生物化學、分子生物學、細胞生物學、細胞遺傳學等基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學研究領域。

流式細胞儀的液流系統(tǒng)由流動室、樣品管、鞘液管和噴嘴組成。樣品在進入流動室之前，其中的細胞或微粒都是以隨機的方式進行移動。在進入流動室之后，樣品在液流壓力的作用下從樣品管中噴出，同時鞘液在高壓下由鞘液管噴出，包裹在樣品流四周，形成穩(wěn)定的同軸流動狀態(tài)，并使其聚焦為窄流，從而將細胞分離成單細胞列，然后從噴嘴高速噴出，形成細胞液柱。樣品流中的細胞或微粒在鞘液的作用下，會以相同的速度逐一通過激光檢測點。

光學系統(tǒng)由激發(fā)光源、分光鏡、濾光片以及產(chǎn)生光電流的檢測系統(tǒng)組成。樣品通過激光時，儀器會記錄各單個細胞的前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）。FSC主要用于檢測細胞的相對大小，細胞越大，產(chǎn)生的FSC就越強。SSC則用于評估細胞的內(nèi)部復雜性，細胞內(nèi)的顆粒成分和精細結(jié)構(gòu)越復雜，產(chǎn)生的SSC就更強。經(jīng)熒光染色的細胞受到合適的光激發(fā)后會產(chǎn)生許多不同波長的熒光信號，分光鏡和濾光片可以將入射的激光束按照特定的角度和波長進行分散和反射，使不同波長的光聚焦于不同的位置上。之后光信號通過光電倍增管（Photomultiplier tube, PMT）轉(zhuǎn)化為電信號，傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

對照設置

首先，我們需要了解非特異性信號產(chǎn)生的原因：比如常見的腫瘤細胞自發(fā)熒光，會造成背景信號干擾；又如在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞上，Fc受體均呈現(xiàn)高表達，在染色過程中抗體Fc端與細胞表面Fc受體的結(jié)合以及抗體與細胞的物理結(jié)合與粘附等，也會造成非特異性染色的發(fā)生；樣本中的死細胞不僅具有更強的自發(fā)熒光，而且更容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，造成假陽性；除此以外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染、藥物處理、體外共培養(yǎng)等也可能會引入熒光信號，對流式檢測結(jié)果造成一定干擾。

為了避免上述情況，在流式染色前需要使用Fc受體阻斷劑對Fc受體造成的非特異性染色加以去除。除此之外，還需要根據(jù)實驗具體情況設置以下幾種對照來排除非特異性信號。

單染對照

由于熒光染料發(fā)射光不是一個單一的波長，而是覆蓋一定范圍，所以會有熒光滲漏到鄰近波長的檢測器，在進行多色流式實驗時，檢測的顏色越多，越容易發(fā)生熒光滲漏。校正溢漏的過程被稱為補償，補償可確保檢測器只計算該通道特定的熒光發(fā)射光。單染對照是只添加一種熒光抗體的樣本，可以顯示出不同熒光基團之間光譜重疊的水平，并據(jù)此去除或補償它們之間的重疊。熒光補償調(diào)節(jié)設定好后，陽性細胞群應位于“目標通道陽性、其他通道陰性"的右下象限，陰性細胞群位于左下象限，兩群體應垂直或平行于橫縱坐標軸，左上象限不應有明顯信號。同時，單染對照還可以輔助調(diào)節(jié)通道電壓，把陽性峰調(diào)節(jié)到合適的位置，防止信號超出接收范圍。

1.單染對照細胞樣本，因為電壓和背景更接近實際樣本，無合適細胞樣本時，可用微球代替。

2.同一通道內(nèi)的熒光染料具有不同的發(fā)射光譜，因此單染樣本的熒光染料必須與實驗樣本中的保持一致，例如GFP和FITC這兩種熒光染料是不能相互替換的，因為兩者的發(fā)射光譜不一致。

3.實驗中有幾種不同的熒光染料，就需要設置幾個單染對照組，一個也不能少。

4.由于復合染料的差異，單染對照的復合染料標記抗體應當與實驗所用的抗體相同（來自同一支抗體）。使用相同的復合熒光染料偶聯(lián)不同的抗體，甚至僅是不同批次抗體，都可能會導致計算結(jié)果不準確。

5.單染對照的染色結(jié)果必須與實驗樣本亮度相同或更高，以模擬實驗中的任何熒光溢漏情況。

6.對于任何對照，陰性和陽性群體的自發(fā)熒光必須相同。做法是單獨為每個通道的陽性和陰性群設門，避免使用通用的陰性對照。

7.單染對照的染色結(jié)果，必須要陰陽分群明顯。全陰性，全陽性或者陰陽分群不明顯的樣本都不可作為單染對照。

8.補償依賴于熒光強度中位值的準確計算，軟件能對熒光的溢出進行統(tǒng)計學顯著性確定，如果事件太少，將無法準確計算，因此事件收集數(shù)量應多于5000個。

9.單染對照和實驗樣本的處理要相同，上機電壓也要保持一致。

10.一些低表達靶標（例如IL-17A、IFN-γ等）的陽性細胞群非常少，調(diào)節(jié)補償時，軟件不能正確識別甚至識別不出，此時可以選擇該樣本高表達的一些靶標（例如CD3、CD4等），用相同的熒光標記來代替低表達靶標。

11.補償值一般不會超過100%，如果出現(xiàn)超過100%的情況，可能是串聯(lián)染料斷裂導致。另外，補償值不會出現(xiàn)負值，如果出現(xiàn)，則表示某些通道存在過補償。

12.軟件自動調(diào)節(jié)完補償，可以打開補償面板，觀察一下每個通道的補償是否合理。若不合理，可以適當進行微調(diào)。

13.為了更合理地圈出陰陽群，我們可以先根據(jù)FSC和SSC，圈出對應細胞群，這樣更有利于調(diào)節(jié)補償。